緒言

このプロトコルでは、最小限のサンプル操作でのフローサイトメトリーによる全血サンプル中の細胞のイムノフェノタイピングについて説明します。このプロトコルにより細胞の損失を抑えながら、細胞の構造と機能を維持します [1,2]。細胞表面マーカーに対する抗体で染色された全血サンプルは、フローサイトメーターで直接解析できます。この解析を実施しやすくするために、全血サンプル中の赤血球（RBC）を抗体染色後に溶解する場合があります。全血中の赤血球と単核細胞の存在比率は約600：1です（サンプルと種に左右されます）。そのため、RBCが存在する場合は、より多くのイベントを取得して希少細胞イベントを観察する必要があります [1,3,4]。RBCの溶解後、全血サンプル中の細胞を透過処理し、細胞内マーカーに対する抗体で染色した後、フローサイトメトリーによる解析を実施できます。


材料


手順

全血調製

  1. ヘパリン処理したチューブ、または全血100 μLあたり1 μLの10%カリウムEDTAを含むチューブに全血を回収します。
  1. 各抗体染色実験では、100 μLの未溶解全血を12 x 75 mmチューブに分注します。単色コントロール（コンペンセーションの設定に使用）ごとに、100 μLの未溶解全血を12 x 75 mmチューブに分注します。未染色のコントロールサンプルとして、追加の未溶解全血を保存します。

細胞表面の染色

  1. フローサイトメトリー染色バッファーを用いて、細胞表面マーカーに対する蛍光色素標識一次抗体を含む目的の抗体カクテルを調製します。最初に、1：50から1：100までの抗体希釈液をテストすることをお勧めします。遮光します。
  1. 全血の100 μL一定分量（アリコート）に抗体カクテルを加えます。
  1. 回転させながら2～8℃で30分から1時間インキュベートします。遮光します。
  1. 2 mLフローサイトメトリー染色バッファーでサンプルを洗浄します。この洗浄ステップは繰り返すことができます。
  1. 500 x gで5分間、4℃で遠心分離します。上清を廃棄し、500 μLのフローサイトメトリー染色バッファーで再懸濁します。

    オプション5b：（固定試薬または溶解試薬を使用する場合は、このステップを含めないでください）SYTOX Dead Cell Stain Sampler Kit, for flow cytometryなどの非透過性核酸色素を添加して生細胞をゲートをかけることができます。この非透過性核酸色素を添加した後、洗浄ステップを加えないでください。500 μLのサンプルあたり0.5 μLのSYTOX Dead Cell Stain Sampler Kit, for flow cytometry 溶液を加え、十分に混合します。室温で20分間、遮光してインキュベートします。
  1. オプション：フローサイトメーターで直接解析する場合は、0.45 μmセルストレーナーで室温で細胞をろ過することで、大きな破片を除去します。


オプション：赤血球の溶解

  1. 100 μLの全血の場合、2 mLの室温に戻した1倍液の1-Step Fix/Lyse Solution (10X)を加え、静かに転倒混和させます。赤血球を溶解すると、フローサイトメトリー解析中にゲーティングがより簡単になりますが、免疫細胞の機能が妨げられる場合があります。1-Step Fix/Lyse Solution (10X)は、固定され標識された白血球集団を維持しながら、無核赤血球を溶解するように処方されています。
  1. 室温で15～60分間、遮光してインキュベートします。
  1. サンプルを遮光し、2～8℃で最大48時間バッファー中に保存します。コンペンセーションの設定のために使用される単色染色サンプルと未染色サンプルは、同じ条件下で保管する必要があります。

プロトコルのコツ：

溶解した血液サンプルや血清に関する染色プロトコルで必要とされる抗体濃度と比べて、全血染色プロトコルで使用される抗体濃度は高い必要があります。

プロトコルのコツ：

ヒト全血中の白血球の無洗浄、無溶解検出によりゲートされ染色された白血球の例を、 Attune NxTフローサイトメーターアプリケーションノートに示します。

フローサイトメトリー解析

  1. 選択した蛍光色素標識に対応する適切なフィルターを備えたフローサイトメーターでサンプルを解析します。
  1. 細胞集団の中で0.1％頻度の事象を見つけ、CV値を1～10%に収めるには、最低107～105件の細胞イベント数を取得しなければなりません。取得速度は、イベントをゆっくりと収集するように設定する必要があります（例：Invitrogen Attune NxTフローサイトメーターでの収集速度は200～500 μL／分）。

プロトコルのコツ：

白血球の濃度は、1マイクロリットルあたり4,000～10,000細胞まで変わります (3)。 統計的に有意な結果となるのに必要な事象の件数を計算して、実験に必要な血液量を推定することをお勧めします (5)。

細胞内染色

  1. 細胞内マーカーを認識する抗体で染色する前に、全血100 μLあたり2 mLの1倍1-Step Fix/Lyse Solution (10X)を使用して、上記のとおり赤血球を溶解し、白血球集団を固定することをお勧めします。静かに転倒混和させ、室温で15～60分間、遮光してインキュベートします。
  1. 10倍濃縮液と蒸留水を1：9で混合することで、10倍透過処理バッファーを1倍に希釈します。
  1. サンプルを500 x gで5分間室温で遠心分離します。上清を廃棄します。
  1. ペレットを2 mLの1倍透過処理バッファーで再懸濁し、500 x gで5分間室温で遠心分離します。上清を廃棄します。1回繰り返します。遮光します。
  1. 細胞ペレットを100 μLのフローサイトメトリー染色バッファーで再懸濁します。
  1. フローサイトメトリー染色バッファーを用いて、細胞内マーカーに対する標識一次抗体を含む目的の抗体カクテルを調製します。遮光します。最初に、1：50から1：100までの抗体希釈液をテストすることをお勧めします。
  1. 抗体カクテルを細胞懸濁液に加えます。
  1. 室温で20～60分間、回転させながらインキュベートします。遮光します。
  1. 2 mLフローサイトメトリー染色バッファーでサンプルを洗浄します。この洗浄ステップは繰り返すことができます。
  1. 500 x gで5分間、4℃で遠心分離します。500 μLのフローサイトメトリー染色バッファーで再懸濁します。
  1. フローサイトメトリーでサンプルを解析します。

プロトコルのコツ：

固定と透過処理は抗体の特異性に影響を及ぼす場合があります。固定条件下で機能する抗体の包括的リストについては、 Intracellular Staining Buffer Selection Guide（細胞内染色バッファー選択ガイド）と、特に"Fixation（固定）&Permeabilization（透過処理）"カラムをご参照ください。


参照

  1. Petriz J, Bradford JA, Ward MD (2018) No lyse no wash flow cytometry for maximizing minimal sample preparation. Methods 134–135: 149-163.PMID 29269150.
  2. Rico LG, Juncà J, Ward MD et al.(2019) Flow cytometric significance of cellular alkaline phosphatase activity in acute myeloid leukemia. Oncotarget 10(65):6969–6980.PMID 31857851.
  3. Blumenreich MS.(1990) The White Blood Cell and Differential Count. In: Walker HK, Hall WD, Hurst JW (editors), Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations.3rd edition.Boston: Butterworths; 1990.Chapter 153.
  4. Song S, Goodwin J, Zhang J et al.(2002) Effect of contaminating red blood cells on OKT3-mediated polyclonal activation of peripheral blood mononuclear cells. Clin Diagn Lab Immunol 9(3):708–712.PMID 11986282.
  5. Allan AL, Keeney M (2010) Circulating tumor cell analysis: Technical and statistical considerations for application to the clinic. J Oncol 2010:426218.PMID 20049168.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.