イントロダクション
組織マクロファージは単球に由来する場合があります。血液から分離し、血清添加培地で培養すると、付着した単球はマクロファージに分化します。ピュアなマクロファージ培養の場合は、M-CSFなどの因子を加えることをお勧めします。IL-4、IL-10、またはTGF-βなど他の因子を添加すれば、生存率を改善できます。以下のプロトコルはT25またはT75フラスコ用ですが、100 mmの培養皿やプレート用に規模を縮小できます。
材料
- 通気キャップ付きのT25またはT75滅菌フラスコ（例：Nunc EasYFlask細胞培養フラスコ、T25、フィルター、カタログ番号156367）
- RPMI 1640培地（例：BenchStable RPMI 1640培地、カタログ番号A4192301）
- ウシ胎児血清（例：Gibcoウシ胎児血清、カタログ番号26140087、またはウシ胎児血清One Shot format、カタログ番号A3160401）
- L-グルタミン（例：200 mM L-グルタミン、カタログ番号25030149）
- オプション：ペニシリン-ストレプトマイシン（例：Gibcoペニシリン-ストレプトマイシン、カタログ番号15140148）
- M-CSF精製タンパク質（例：Gibco M-CSF組み換えヒトタンパク質、カタログ番号PHC9504）
- オプション：IL-4精製タンパク質（例：IL-4組み換えヒトタンパク質、カタログ番号A42602）
- リン酸緩衝生理食塩水（例：Gibco PBS（10倍濃度）、pH 7.4、カタログ番号70011044）
- EDTA（例：UltraPure 0.5 M EDTA、pH 8.0、カタログ番号15575020）
- 50 mLコニカルチューブ（例：Nunc 50 mLコニカル滅菌済遠心チューブ、カタログ番号339652）
- フローサイトメトリー染色バッファー（例：eBioscienceフローサイトメトリー染色バッファー、カタログ番号00-4222-26）
手順
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プロトコルのコツ：
Nunc UpCellディッシュ上で単球を培養すると、細胞回収中の細胞の生存率と表面タンパク質を維持できます。UpCell Surfaceを備えたNuncディッシュを使用すると、解離酵素（例：トリプシン、EDTA）を必要とせずに温度の低下により細胞を回収できるため、細胞膜と細胞表面受容体が維持されます。
補足プロトコルA：全血からのPBMCの単離
材料
- リン酸緩衝生理食塩水（例：Gibco PBS（10倍濃度）、pH 7.4、カタログ番号70011044）
- 15 mLまたは50 mLコニカルチューブ（例：Nunc 15 mLコニカル滅菌済遠心チューブ、カタログ番号339650）
- Ficoll-Paque®密度分離培地
- フローサイトメトリー染色バッファー（例：eBioscienceフローサイトメトリー染色バッファー、カタログ番号00-4222-26）
手順
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注：
細胞を培養するので、すべてのステップを無菌手法を用いて実施し、また、アジドを含まないバッファーを使用します。プロトコルのコツ：
自動カウンターを使用すれば、採取したばかりの末梢血単核細胞からの細胞の健康状態および濃度の評価の正確性が大幅に向上します。 Countess II FL自動細胞カウンターを使用してPBMCを計数する方法に関する 詳細なプロトコルをご参照ください。For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.