オリゴデザインツール

プライマーデザインのヒント

• 一般に、プライマーの長さは 18 ～ 3 0 ヌクレオチドが適しています。
• プライマーの融点（T_m）が 65 ～ 75 °C であり、プライマー同士の温度差が 5 °C 以内であるようにデザインします。
• プライマーの T_m が低すぎる場合は、GC 含量が高い配列を探すか、プライマーを少し長くします。
• GC 含量は 40 ～ 60％とし、また、結合を促進するためにプライマーの 3' 末端は C または G となるようにします。
• 切断が効率よく行われるように、プライマーの制限酵素認識部位の 5' 側には通常 3 ～ 4 ヌクレオチドを付加します。
• 2 次構造を形成する領域を避け、また、GC リッチな部分と AT リッチな部分をバランスよく分配します。
• 1 種類の塩基が 4 個以上続くことや、ジヌクレオチドの繰り返しとなることを避けます（例：ACCCC や ATATATAT）。
• プライマー内部の相同配列（プライマー内で 3 塩基以上が相補的になる）や、プライマー間の相同配列（フォワードプライマーとリバースプライマーの間に相補的な配列がある）を避けます。  このような配列があると、希望する DNA 配列にアニーリングする代わりに、自己二量体またはプライマー二量体が生じます。
• クローニングのためにプライマーを使用する場合は、カートリッジ精製以上の精製グレートをお勧めいたします。
• 突然変異生成のためにプライマーを使用する場合は、ミスマッチ塩基がプライマーの中央にくるようにしてください。
• Invitrogen TOPO クローニングに使用するための PCR 反応にプライマーを使用する場合は、リン酸修飾したプライマーは使用しないでください。