蛍光マイクロプレートアッセイ

蛍光マイクロプレートアッセイを最適化するためのガイドライン

1. 最適な励起および蛍光フィルター、または波長を選択してください。励起波長および蛍光波長のデータは、製品マニュアルまたはクイックレビューカードに記載されています。検出試薬と機器のスペクトルが適合していない場合、シグナルの損失が大きくなる可能性があります。
2. 蛍光シグナルを最大化するよう、機器の感度設定を調節してください。最大限の線形ダイナミックレンジを達成するために、予測される最低および最高のアッセイ値の両方に適している最高ゲインまたは感度設定を選択してください。
3. サンプル量を均一に揃えてください。サンプル量のわずかな違いにより、シグナルが大きく異なる可能性があります。信頼性の高い測定値を得るために、機器製造元が推奨する最低量を使用してください。
4. サンプルを十分に混合してください。サンプルの混合が不十分な場合、凝集、沈殿、反応効率、ウェル間の分析物または検出試薬の濃度にばらつきが生じます。
5. 気泡を避けてください。アッセイ溶液中の気泡は、光散乱や誤ったシグナルの原因となります。マイクロプレートを軽く遠心し、分注の前に溶液を脱気（生細胞アッセイでは行いません）、または大きな泡はピペットチップで除いてください。
6. 複製サンプルを準備してください。複製サンプルを測定することで、測定の精度が向上します。
7. 「エッジ効果」を回避してください。スペクトル的に適切な蛍光色素分子溶液を用いて、マイクロプレートのすべてのウェルから得られる蛍光シグナルの均一性を確認できます。マイクロプレートの端のウェルでシグナル強度に差異が認められた場合は、適切な補正因子を適用するか、これらのウェルは使用しないでください。
8. 蛍光強度の高いサンプルは他のサンプルと離れたウェルで測定してください。透明なマイクロプレートでは、蛍光が強いサンプルは、隣接するウェルで観察されるサンプルのシグナルに影響を及ぼします（ウェル間ウェルクロストーク）。蛍光が強いサンプルのウェルの隣を空もしくはブランクにするか、隣接したウェルにはそのサンプルと同程度の蛍光強度を有するサンプルをロードしてください。透明プレートの代わりに白色または黒色のマイクロプレートを使用してください。
   
9. 光褪色したサンプルは避けてください。どうしても必要でない限り、サンプルを再測定しないでください。一部の蛍光試薬では、測定によって顕著な光褪色が生じる場合があるため、スタンダードを再利用しないでください。
10. アッセイ範囲内のサンプル濃度を使用してください。未知のサンプルについては、さまざまな希釈率を検討してください。