異常なリン酸化状態は、がんなど、多くのヒト疾患に関係しています。重要なタンパク質標的のリン酸化および翻訳後修飾を研究することは、疾患の根底をなす機序を理解するために不可欠です。
弊社は、STAT3、CREB、PRAS40、p38、AMPKアルファ、PTK2、カスパーゼ 3 シグナル伝達などさまざまな疾患に関係する重要な標的やシグナル伝達経路の多くについて、リン酸化特異的 ELISA キットを取り揃えています。これらのキットは、優れた品質と再現性の確保に役立つように製造されています。このキットは、感度、ダイナミックレンジ、精度、特異性、リカバリー率、ロット間の一貫性について品質管理された仕様を満たさなければなりません。
Invitrogen サンドイッチアッセイキットには、次の 2 つのスタイルがあります。
これらの「リン酸化 ELISA」キットは、事前にコーティングされたキャプチャー抗体、ならびにサンプル、検出用抗体、他の試薬の段階的添加など標準的なサンドイッチ ELISA フォーマットを使用しています。このキットには、標準タンパク質が付属してるため、標準曲線を作成して定量的な結果を得ることができます。
リン酸化 ELISA キットの一般的なプロトコルは以下のとおりです。96 ウェルプレートの底にキャプチャー抗体を事前にコーティングします。細胞抽出物または標準品をウェルに加え、インキュベートして、標的タンパク質が結合できるようにします。次いで、ウェルを洗浄して未結合物質を除去し、検出用抗体を加え、インキュベートして目的のタンパク質の周りにサンドイッチを形成させます。その後、HRP 抗ウサギ抗体を加え、インキュベートしてウサギ由来検出用抗体への結合を可能にさせます。次に、HRP 用発色基質を添加すると、その後の酵素反応で溶液が青色に変わります。最後に、反応を停止すると、サンプル中の標的タンパク質の量に比例して溶液が黄色に変わります。マイクロプレートリーダーで 450 nm の吸光度を読み取ります。
標準的な Invitrogen リン酸化 ELISA キット手順の概要。
InstantOne アッセイプロトコルにおいて、標的分析物が溶液中で 2 つのサンドイッチ ELISA 抗体に結合すると同時に、キャプチャー抗体は独自の機序によってプレートに結合します。そのため、サンプルとアッセイ試薬の両方を同時に InstantOne ELISA アッセイプレートに加える場合があります。未結合のアッセイ試薬と非特異的なサンプル成分は洗い流されます（従来のサンドイッチ ELISA のように）が、特異的な分析物は比色検出によって検出されます。
InstantOne ELISA アッセイでは、従来のサンドイッチ ELISA フォーマットを使用しますが、大きな違いがあります。キャプチャー抗体が独自の機序を介してプレートに結合するので、InstantOne は、標的分析物を溶液中の 2 つのサンドイッチ ELISA 抗体の両方に結合させることによって、より優れた柔軟性、使いやすさ、およびアッセイ時間の短縮を可能にします。これにより、サンプルとアッセイ試薬の両方を InstantOne ELISA アッセイプレートに同時に加えることが可能になります。未結合のアッセイ試薬と非特異的なサンプル成分は、従来のサンドイッチ ELISA のように洗い流されますが、特異的な分析物は比色検出によって検出されます。1時間あまりでプロセス全体が完了します。
InstantOne ELISA がもたらす 1 時間／1 回洗浄の容易さに加えて、従来のサンドイッチ ELISA ではなかなか達成できない柔軟性が加わります。抗体はウェル中で事前にコーティングされていないので、いくつかの異なる標的を同じプレートの異なるウェル中で同時に分析することができます。単に、プレートウェルにサンプルライセートを加え、異なるウェルに異なる抗体試薬カクテルを加えます。同じプレート内で、ファミリーメンバー全体または下流経路にわたり、全標的およびリン酸化された標的の両方を分析するのは、これまで決して容易ではありませんでした。
Invitrogen InstantOne ELISA キット手順の概要。
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