制限酵素消化とライゲーションによるクローニングは、二本鎖 DNA のフラグメントを特定のプラスミドから別のプラスミドに移動するためのシンプルかつ簡単な方法です。
開始方法:
- 認識するシーケンスが目的遺伝子に隣接する制限酵素を選択
- 推奨されている時間通りに反応をインキュベート
- フラグメントを精製
- 目的のプラスミドにライゲーション
Invitrogen Anza 制限酵素クローニングシステム
制限酵素および DNA 修飾酵素の完全なシステム—非常にシンプルなクローニングを実現。
- すべての制限酵素に 1 つのバッファー
- すべての DNA タイプに 1 つの消化プロトコル
- 消化は 15 分間で完了
- スター活性のないオーバーバイト消化
Anza buffer
従来型の制限酵素
制限酵素(RE)は、特異的な 4 ~ 8 塩基対の反転反復認識配列の部位で二本鎖 DNA を切断することで機能します。DNA 開裂の産物は平滑端末であるか、5′ または 3′ オーバーハングを含みます。
DNA 修飾酵素
リガーゼ
制限消化によって生成された末端のタイプに関わらず、DNA の開裂により、末端に 3′ 水酸基および 5′ リン酸基を持つフラグメントを生成します。DNA リガーゼは ATP 依存した反応により二重鎖 DNA (あるいは RNA) の 5′ リン酸基と 3′ 水酸基を共有結合的に結合します。
アルカリホスファターゼ
アルカリホスファターゼは DNA や RNA から 3′ および 5′ リン酸を加水分解します。これは、末端を標識する前に 5′ リン酸基を除去したり、インサートのライゲーションの前にベクターを脱リン酸化するのに適しています。これはまたタンパク質の脱リン酸化にも使用できます。
末端修復
末端修復により、5′ または 3′ のオーバーハングを持つ DNA が 5′ リン酸化平滑端末 DNA に転換され、平滑端末クローニングベクターへの効率的なライゲーションを可能にします。
ポリヌクレオチドキナーゼ
ポリヌクレオチドキナーゼは、DNA やオリゴヌクレオチドの 5’ リン酸化に使用されます。クローニングのライゲーションステップで使用する DNA を調製する際、インサート DNA またはベクター DNA は 5’ 末端がリン酸化されている必要があります。PCR で増幅された DNA は通常 T4 PNK で処理され、それに続くクローニングライゲーション用に 5’ 末端をリン酸化します。
DNA 平滑化
DNA 平滑化キットは、接着末端を持つ DNA が平滑末端を持つ DNA に転換するのを可能にし、平滑末端のライゲーション反応に使用できるようにします。これは、目的のベクターが平滑末端を生成する認識サイトを含まない場合に有用です。
ポリメラーゼ
ポリメラーゼは平滑端末の生成や標識 DNA の取り込みに使用されます。
- DNA ポリメラーゼ
- DNA 修飾酵素の全リストをご覧ください
リソース
クローニングサポートセンター
クローニングアプリケーションに関するヒント、トラブルシューティングヘルプおよびリソースが見つかります。
クローニングエジュケーション
分子クローニングや組換え技術の基礎に関する詳細をご覧ください