フローサイトメトリー実験プロセス—スペクトルと従来型

ここでは、従来型（補正ベース）およびスペクトル（スペクトル分解ベース）のフローサイトメトリーでのハイライト表示のための実験プロセス、それらの類似点とそれらの違いについて説明します。

従来型のフローからスペクトラルへのマインドセットへ - 大いなる再考

本ページの内容

概要
従来型およびスペクトルフローサイトメトリー

従来のフローサイトメトリーとスペクトルフローサイトメトリーの比較

概要

フローサイトメトリーは、細胞の同定および特性評価や目的タンパク質の発現分析の確立に幅広く使用される強力な研究ツールです。スペクトルフローサイトメトリーを用いた実験およびパネルデザインの原理は、従来のフローサイトメトリーと似ています（図1）。各実験は、明確で検証可能な仮説に基づいた1つの質問に答える必要があります。正確で再現性のあるデータを生成するためには、生物学的な問題を特定し、適切な実験デザインを確立することが最も重要です[1]。

Graphic showing the flow cytometry experimental process

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図1.フローサイトメトリー実験プロセスの概要。

生物学的な問題が確定したら、仮説に対処するために必要な細胞または組織の種類を決定する必要があります。細胞集団の有無、相対的な集団の割合、細胞数、蛍光強度など、必要なバイオマーカーと使用する指標は、生物学的に決定されます。これは通常、文献の徹底的なレビューによって達成することができます。このレビューは、生物学的システム、細胞、または目的のタンパク質に性質が類似している査読済み研究に焦点を当てる必要があります。これにより、実験の設計と実施に関する重要な考慮事項、およびフローサイトメトリー取得用のサンプル調製に伴う課題を明らかにします。複数のマーカーを組み合わせて評価すると、より正確で包括的な評価が得られます。スペクトルフローサイトメトリーは、免疫細胞と疾患動態のさまざまな相互作用を完全に理解するための理想的なツールです。

実験計画の初期段階では、統計学者やバイオインフォマティクスの専門家に相談して、実験計画、サンプルサイズの決定を支援し、研究課題をサポートするためのデータ分析の戦略を探索することが有用です。この計画段階では、結果の公表にどのような情報が必要になるかを検討することも有用です。フローサイトメトリー実験に関連し、MiFlowCyt出版物の要件チェックリストは、必要最小限の実験情報が適切に提供されることを保証します[2]。

詳細を見る：ワークリソースセンターで閲覧可能な免疫学の知識

従来のフローサイトメトリーとスペクトルフローサイトメトリー

サンプルの種類と処理の決定

フローサイトメトリーを使用するには、サンプルを調製し、調べるために単細胞懸濁液に処理する必要があります。ほとんどのサンプルでは、抗体標識の調製においてある程度の処理が必要です。サンプル処理の主な目標は、標識用の生細胞の単細胞懸濁液を調製することです。サンプル調製中に生じる問題には、細胞凝集（細胞の塊状化）、細胞死、細胞活性化、エピトープの変化やタンパク質の消失（排除、内在化）などがあります。サンプルの質は、生成されるデータの品質を決定することに注意することが重要です。

特にインキュベーション時間、温度、試薬／バッファーの選択、サンプル処理時間に関して、サンプル調製を徹底的に最適化および標準化します。サンプル処理温度は、使用する生体システムおよび試薬/バッファーと合わせる必要があります。一般的に、処理技術は最小限の侵襲性であるべきで、サンプルのラベリングに使用するだけです。サンプル処理後、サンプルの質を判断するには目視検査をお勧めします。また細胞数または細胞濃度の測定は、その後の抗体染色やフローサイトメトリー評価のために細胞を定量するために必要です。細胞の培養方法に応じて、特定の細胞処理方法があります。非接着性/接着細胞および組織に関する考慮事項は以下のとおりです。

非接着細胞—一般的に、フローサイトメトリー解析用にサンプルを調製するための最小限の操作が必要です。密度勾配遠心分離は、特に末梢血、臍帯血、骨髄からのヒト単核細胞の分離と濃縮に一般的に使用される方法です。より最近の閉鎖系アプローチでは、サイズと密度に基づいて細胞を分離する細胞分離のためのカウンターフロー遠心分離を利用しています。もう1つの一般的なアプローチは、ヒトおよびマウスの造血組織血液用の塩化アンモニウムベースのRBC溶解バッファー、または複数の動物種に対応するバッファー組成で赤血球（RBC）を除去することです。非接着性の細胞であっても、サンプルを流す直前にナイロンメッシュでサンプルをろ過することを常にお勧めします。これにより、サイトメーターが詰まるリスクが低減されます。
接着細胞—機械的手段または化学的手法を用いて培養容器から細胞を剥がすことが可能です。細胞のスクレイピングは培養容器から細胞を物理的に剥がすように設計されており、トリプシンなどの酵素やEDTAなどの他の解離試薬を使用できます。タンパク質検出が酵素自体またはプロトコルによって変化しないように、酵素の使用を検証する必要があります。接着細胞を処理した後、細胞の小さな塊が存在し、ナイロンメッシュを通して細胞懸濁液をろ過することによって除去することができる。培地へのDNaseおよびEDTAの添加、またはカルシウム濃度の除去/低減も、細胞の凝集を最小限に抑えるのに役立つ場合があります。もう1つの手法は「希釈」で、細胞懸濁液のサンプルを小さなニードルで数回前後に吸引し、細胞凝集体を分散させます。単一細胞を懸濁液にすることは、細胞染色に重要です。サイトメーターで実行する前に、できるだけ多くの細胞凝集を除去することが推奨されます。フローサイトメーターでサンプルを流す直前にナイロンメッシュを介してサンプルをろ過することで、サイトメーターの目詰まりのリスクを低減できます。
組織—初代組織からの細胞の解離は組織の種類に依存し、単一細胞懸濁液を作製するために機械的手法や酵素消化が必要な場合があります。外科用ハサミを使用すると、小組織片の生成に続いてサンプルろ過や、組織分離器具やキットを使用することができます。組織処理用の多くの試薬は、4~37°Cの特定のインキュベーション温度を必要とします。ただし、組織の種類および目的の抗原によって異なります。単一細胞懸濁液が得られたら、サンプルを非接着細胞または接着細胞と同様に処理して、抗体染色を調製できます。

あらゆる種類の細胞や組織で、実験の過程で単離、増殖、および凍結保存が必要になる場合があります。これらのテクニックを実行する際に考慮すべき点をいくつか示します。

細胞の単離と増殖—磁気分離技術とfluorescence activated cell sortingのどちらも、純度が高く生存している、機能的な細胞を単離するために使用できます。細胞分離は、ネガティブアイソレーション、ポジティブアイソレーション、およびディプリ―ションを用いて、目的の細胞を分離できます。T細胞の活性化および増殖ワークフローにより、続くアプリケーションにおける細胞生存率を維持しながら、健全なT細胞の単離、活性化、および増殖が可能になります。
凍結保存—場合によっては、サンプルを後で使用するために細胞を保存できるよう、処理後に凍結保存が必要になる場合があります。凍結保存プロセスでは、細胞の生物学的機能は制御された冷却によって維持され、極低温で保存されます。すぐに使用できるようになったら、クライオバイアルを37℃のウォーターバスに入れて、凍結細胞を解凍します。細胞はすぐに使用することも、使用前に休ませておくこともできます。細胞の休止はタンパク質発現に影響を与える可能性があり、標準化されたサンプル調製プロセスの一部として最適化する必要があります。凍結保存と融解は、新たに調製した細胞と比較して細胞の生存率を変化させ、サンプルをフィルターに通して解析中に死細胞を同定／除去する必要があります。

詳細を見る：フローサイトメトリーのプロトコル
探索する：細胞の分離と培養増殖

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Gibco細胞培養の基礎: 基本的な細胞培養技術と、継代、凍結、解凍の方法について学びます。技術に慣れていない方も、知識を更新する必要がある方も、一貫した結果を得るのに役立ちます。

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目的の抗原を特定する

初期の実験計画には、目的の抗原を同定し、表面または細胞内発現を有する抗原として分類することが含まれます。研究者は、以前に発表された文献を用いて、対象の細胞集団を同定する抗原の組み合わせを解明することができます。特に関心のあるリソースは、Optimized Multicolor Immunofluorescence Panel（OMIP）です。これは、ジャーナルCytometry Aに掲載されている出版物で、従来のフローサイトメトリーとスペクトルフローサイトメトリーの両方に最適化されたマルチパラメーターパネルが掲載されており、マルチカラーパネルの開発に携わる他の研究者をサポートします[8]。Cytometry Aにあるもう1つの有用なツールには、研究者がさまざまな細胞タイプを特定するのに役立つように設計された「Phenotype Reports」と呼ばれるミニレビューがあります[9]。

詳細を見る：BioProbes 74: Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels (OMIPs)
探索する：最適化されたフローサイトメトリー・マルチプレックスパネル

抗体のカテゴリーと抗体の検証

抗体ベースの研究の目的は、特定のターゲットとアプリケーションに適した試薬を選択することです。抗体は基礎科学研究において重要なツールであり、フローサイトメトリーなどの多くのプラットフォームでイムノフェノタイピングに使用されています。3種類の抗体を定義できます。

ポリクローナル抗体—これらは、複数のB細胞により産生された抗体の不均一な混合で構成され、それぞれが同じ抗原上の異なるエピトープを認識します。ポリクローナル抗体は単一のエピトープに特異的ではないため、交差反応の可能性が高くなります。
モノクローナル抗体—これらは単一のB細胞の親クローンから産生されるため、抗原ごとに単一のエピトープを認識します。これらのB細胞は、同一のモノクローナル抗体を長期間生成するハイブリドーマ細胞との融合により不死化されています。モノクローナル抗体は抗原上のエピトープを特異的に検出するため、他のタンパク質との交差反応の可能性が低くなります。
組換え抗体—組換え抗体は、抗体コーディング遺伝子を使用して生成され、多くの場合、重鎖および軽鎖の可変領域（ターゲットに結合する抗体の部分）のみで構成されます。組換え抗体は、Fc部分がないため免疫原性が制限され、医学において非常に有用性があります。フローサイトメトリーでは、これらの抗体はバックグラウンドシグナルに影響することが多いFc受容体に結合できないため、この特性も有益な場合があります。

フローサイトメトリー実験で再現性を向上させるために、一般的に、モノクローナルまたは組換え抗体の使用をお勧めします。最近の論文では、抗体バリデーションの普遍的な標準が欠如していることに言及しており、偽陰性、偽陽性、または一貫性のない結果が生じる可能性が強調されています[10–11]。抗体バリデーション国際ワーキンググループ（IWGAV）は、抗体の使用基準を改善するためのガイドラインを提案しており、アプリケーションに応じた方法で使用するための抗体バリデーションのフレームワークを提供しています[12]。フローサイトメトリー実験で有効な所見を提供する抗体には、特異的かつ選択的で、高感度であり、最適な希釈で再現性のある結果を提供する必要があります[13]。抗体バリデーションの原理に関する知識により、研究者は製造業者や開発者から提示されたデータに基づいて抗体試薬を慎重に選択し、信頼できるサプライヤーから抗体試薬を調達することができます[14]。各抗体を標的特異性および機能的アプリケーションの両方について試験することで、抗体が適切なターゲットに結合し、使用する特定のアプリケーションで機能することを確認できます。抗体サプライヤーがバリデーション情報を提供すると、エンドユーザーが独自の設定で抗体の性能を検証するようになります[15]。

詳細を見る：一次抗体タイプのガイド

抗原密度と発現パターン

抗原発現パターンと抗原密度レベルを理解することは、確固たるパネルを開発し、明確な細胞サブセットを確実に分離する上で最も重要です。抗原には、細胞上または細胞内の量に直接相関する相対密度を有しています。これは、フローサイトメトリーでしばしば低、中、および高と表現されます。一部の抗原は高度に特徴づけられているが、他の抗原の構造と機能は不明なままです。一部の細胞表面タンパク質の発現レベルに関するリソースがまとめられており、有用な情報が提供されています[16–18]。これらの特性により、フローサイトメトリーパネルのデザインに有用な段階的な抗原の分類につながっています[19]。目的の抗原が判明したら、予備的なゲーティングストラテジーの概要を説明することで、抗原間の関係、発現パターン、および分解能を最大化する場所を明確にすることができます（図2）。

Hand drawn sketch showing gating strategy

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Workflow showing gating strategy from a published protocol

Graphs showing co-expression of fluorophores

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図2.ゲーティングストラテジー。目的の細胞を識別するためのターゲット集団とマーカーを選択したら、ゲーティングストラテジーを立てる必要があります。これは簡単に描画することができます(A)、または系統樹を使用することから始めることができます(B)または公開されたプロトコルに従うこともできます(C)。マーカーを蛍光色素と組み合わせる際には、どのマーカーが共発現し、相互に排他的な発現を持つかを理解することが不可欠です。

研究者は、解析に必要な細胞集団を注記し、目的の細胞を識別するために必要な系統マーカーを定義し、共発現するマーカーを強調する必要があります（図3）。この段階で抗原とその特性を評価することができます。抗原の種類と特性を以下に示します。

一次抗原—特性評価されており、細胞の主要なサブセットを同定できます。これらはしばしば系統マーカーと呼ばれます。
二次抗原—十分に特性評価されていることが多く、抗原密度が高いものの、連続的または広範な発現パターンを有する場合があります。
3次抗原—低レベルで発現しているか、特性評価されていないもののいずれかです。

Visual for how to determine co-expression

図3.共発現を決定します。スプレッドの問題は、細胞が2つ以上の抗原を共発現する状況に影響します。どのターゲットが共発現しているかを決定し、類似性の低い蛍光色素を選択できます。排他的な発現を持つターゲットには、類似性が高い蛍光色素の使用は控えます。

適切な抗体クローンの決定は、特定のアッセイ、ターゲットの局在性、および異なる処理法に対する感度を考慮する必要があります。サプライヤーが提供する抗体データシートは貴重な情報源であり、抗体クローンおよびアイソタイプ、種反応性、エピトープ、試験済みアプリケーション、プロトコル、使用する推奨抗体濃度、蛍光色素コンジュゲート、およびサンプルデータなどが記載されています。これは抗体のデータシートの例です。さらに、Webベースのプラットフォームは、ターゲットに関する貴重な比較情報や関連文献へのリンクを提供することができます[20–21]。

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従来のフローサイトメトリー対スペクトルフローサイトメトリー

機器の構成

使用しているフローサイトメーターまたはソーターの構成と機能によって、パネルのデザインが決まります。どの蛍光色素を効果的に検出できるかを判断するには、機器の光学構成を確認します。これには、利用可能なレーザー、レーザー波長、出力、レーザーが共線形または空間的に分離されているか、光路、および結果として生じる発光を捕捉する光検出器の数と種類のチェックが含まれます[3]。スペクトルフローサイトメトリーでは、利用可能なすべてのレーザーや検出器から得られた蛍光シグナルは、特定の蛍光色素分子に対してより詳細なスペクトル特性を生成します（図4）。

Graphs showing spectral signatures of APC comparing 1 and 5 laser excitation

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図4.APCのスペクトル特性、1本あるいは5本のレーザー励起での比較。（A）単一のレーザー励起による蛍光色素APCの標準化された発光スペクトル特性（従来のフローサイトメーターでも確認）。（B）5本のレーザー励起によるAPCの標準化された発光スペクトル特性（スペクトルフローサイトメトリーで確認）。追加のレーザー励起によって得られた二次発光により、スペクトル特性のより詳細な情報が得られます。

この追加情報により、ピーク発光はほぼ同一であるがオフピーク発光は異なる蛍光色素を区別するのに役立ちます。たとえば、アロフィコシアニン（APC）とAlexa Fluor 647色素のスペクトル特性を比較すると、単一のレッドレーザーで励起された場合の発光にわずかな違いしか明らかになりません（図5）。しかし、レッドに加えてUV、バイオレット、ブルー、イエロー／グリーンレーザーなどの追加のレーザーから発光シグナルを収集すると、APCおよびAlexa Fluor 647色素の独自のシグネチャが出現し、スペクトルフローサイトメトリーパネルで組み合わせて使用できるようになります（図5）。一部の機器は、アッセイ設定と呼ばれる、適切な機器設定を備えています。これらの最適化された検出器設定は、蛍光色素のスペクトル独自性を維持しながら、検出器アレイ全体で最良のシグナル分解能のバランスを取ることを目的としています。メーカー開発の機器設定はほとんどの状況に適切ですが、場合によっては、検出を最大化したり、シグナルの飽和を防止するために最適化が必要になる場合があります。

Graph showing spectral signature of overlapping fluorophores

図5.高度にオーバーラップする蛍光色素のスペクトル特性の比較。APC（ハッシュライン）およびAlexa Fluor 647色素（灰色）の標準化されたスペクトル特性のオーバーレイは、2つの蛍光色素間の違いを示しています。

探索する：フローサイトメーターを購入する際の考慮事項
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機器と蛍光色素の特性評価

機器の構成を決定したら、次のステップは特定のサイトメーターで色素を特性評価することです。サイトメーターでの色素の特性評価は、最初に複数の蛍光色素を実行して、サイトメーターの出力がどのように見えるかを確認することから始まります。使用可能なすべての蛍光標識CD4抗体（または他のよく知られているターゲット）で解析し、スペクトル特性を調べて、適合性のあるものを判断するのが一般的です。適合性には、どの蛍光色素がオーバーラップしているか、またはパネルを拡張するために使用する他の蛍光色素を検索するためにスペクトル特性のどの領域を利用できるかを調べることが含まれます。

この目的のために、装置上またはWebベースのスペクトルビューアを参照することができます。これらのツールは一般的に、波長に対する標準化された強度をプロットすることにより、蛍光色素の励起スペクトルと発光スペクトルを表示します。スペクトルビューアーの中には、適合する蛍光色素のスペクトル特性を示す機器固有の構成を提供するものもあります。機器の構成や検出器感度の違い、蛍光色素のばらつきにより、スペクトルの特性はスペクトルビューアーで表示されるデータと特定の装置で得られるデータとでわずかに異なる場合があります。お客様の機器構成を利用するスペクトルビューアーおよびパネルビルダーツールを使用すると有益です。スペクトルビューアーおよびパネルビルダーツールは、蛍光色素のスペクトルを重ね合わせて蛍光色素間の類似性指数を計算することができます。類似性インデックスの例については、スペクトルフローサイトメトリーパネルデザインページをご覧ください。

類似性指数は、2つの蛍光色素の発光曲線のオーバーラップを定量的に評価する比較機能で、ユニークから同一までのスケールで評価します。ゼロに近い値は、2つの蛍光色素のスペクトル特性が大きく異なり、比較対象の2つの蛍光色素のオーバーラップが最小限に抑えられることを意味します。100に近い値は、スペクトル特性が互いに非常に似ていることを示します。過剰なデータのスプレッドを制限し、シグナルを分解できないリスクを低減するために、類似性指数が98を超える蛍光色素の使用を避けることをお勧めします。90～98の間の高い類似性値は高いスプレッドと相関する可能性があり、特に抗原が共発現している場合は注意して使用する必要があります。共発現する抗原に対応する蛍光色素を選択する際は、類似性測定値が70を超える抗原を避けることをお勧めします。蛍光の詳細については、Molecular Probes蛍光教室ー蛍光の基礎をご覧ください。

試薬を評価する際のもう1つの重要な考慮事項は、抗体が結合する使用可能な蛍光色素の相対輝度です（図6）。

Stain index showing relative fluorophore brightness

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図6.染色インデックスは、蛍光色素の相対的な明るさを測定します。単離したフレッシュなPBMCを、5種類の蛍光色素に結合した抗ヒトCD4抗体で標識しました。データは、リンパ球ゲートを使用した5レーザーAuroraスペクトルサイトメーターを使用して取得しました。未染色（青）および染色したリンパ球（紫）のヒストグラムオーバーレイプロットは、左から右に向かって輝度と染色インデックスが上昇しています。

細胞を特定の機器構成で同一の条件下で同じ抗体の異なる蛍光標識抗体で染色するため、染色インデックスまたは分離インデックスを計算して蛍光色素を評価し、相対輝度をランク付けします。通常、CD4抗体は、明確に定義されたポジティブ集団とネガティブ集団を有し、市販されているほとんどの蛍光色素に直接結合した状態で利用できるため、使用されます（図7）[4–6]。

Graph showing relative stain indices for multiple fluorophores

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図7.相対染色指数。単離されたばかりのPBMCは、さまざまな蛍光色素に結合した抗ヒトCD4抗体で標識し、リンパ球ゲートを用いて5レーザー搭載のAuroraスペクトルサイトメーターを使用して取得しました。各蛍光色素の染色インデックスを計算し、暗いものから明るいものまですべての蛍光色素の相対染色インデックスをランク付けしました。蛍光色素輝度に関する染色インデックスのPDFをダウンロードして、利用可能なすべての蛍光色素を確認してください。

利用可能な蛍光色素の数が増え続けているため、蛍光色素の主要な特性を理解することが不可欠です。パネルデザインで蛍光色素と抗体を組み合わせる場合は、相対的な輝度情報を使用します。一般的に、低密度抗原には明るい蛍光色素を、高密度抗原には暗い蛍光色素を組み合わせることが推奨されます。もう1つの考慮事項は、蛍光色素のスペクトルがいかにユニークであるか、ユニークであればあるほどスプレッドが起こりにくくなります。スプレッドのより詳細な説明については、スペクトルフローサイトメトリーのパネルデザインページをご覧ください。

独自のスペクトルと最小限のクロスレーザー励起を持つ新しい蛍光色素の開発は、スペクトルのスピルオーバーとスプレッドを最小限に抑え、データ分解能を維持するように設計されているため、スペクトルフローサイトメトリーに最適です。可能であれば、スペクトルパネルデザインの最初のステップとして、未染色サンプルの自己蛍光特性を得ることで、蛍光色素を選択する際に回避または優先すべきスペクトル領域を視覚化し、データ分解能を維持するのに役立ちます。

探索する：イムノフェノタイピング用NovaFluor色素
探索する：蛍光色素の輝度を示す染色インデックス

スプレッドとスピルオーバーの比較

従来のフローサイトメトリーでは、ある蛍光色素からの発光が別の蛍光色素に割り当てられた検出器にこぼれることを「スピルオーバー」と呼んでいました。コンペンセーションが適用されると、スピルオーバーが補正されます。スペクトルフローサイトメトリーでは、スピルオーバーはスペクトルのオーバーラップとしてより正確に記述され、データは複数の検出器間で混合されず、各蛍光色素の固有のスペクトル特性を単離します。スプレッドは、検出器の不正確さによる蛍光強度の広がりをもたらす光子計数誤差を指します。補正またはスペクトルのアンミキシングが適用された後、スピルオーバーを受けた検出器において、陽性集団のブロード化または拡散が生じることで、スプレッドは可視化されます。（図8）[7]。理想的には、蛍光のオーバーラップがない、固有のスペクトル特性を持つ蛍光色素のみをパネルで使用されます。しかし、類似したスペクトル特性を持つ蛍光色素をパネル内で併用することで、スプレッドが起こることを理解できます。スプレッドの影響を最小限に抑えるための措置が必要になる場合があります。

Graphs showing spreading before and after unmixing

図8.アンミキシング後に明らかになったスプレッド（拡散）。リンパ球はCD4-PEで単独で標識され、アンミキシング前（A）およびアンミキシング後（B）に、PE vs（非標識）PerCP-Cyanine 5.5を比較しました。アンミキシング後のデータでは、PerCP-Cyanine 5.5標識と組み合わせた場合、共発現集団の検出を損なう可能性のあるPE蛍光が有意に拡散していることが明らかになっています。

スペクトルフローサイトメトリーを使用してアンミキシングされたデータ、または従来のフローサイトメトリーを用いて補正されたデータは、スピルオーバーを受けた検出器において陽性集団の広がりを明らかになります。アンミキシングやコンペンセーションは、光子計数誤差がすでに存在するため、誤差を引き起こしたり変化させたりはしませんが、誤差をログスケールの下限にシフトさせることにより、誤差をより明白にします。スプレッドは感度と解像度を低下させ、パネルサイズが大きくなるにつれて重要な考慮事項となるため、問題となる場合があります。スプレッドの一般的な原因は、蛍光色素が同じスペクトル領域で発光し、類似性が高く、非常に明るい蛍光色素を使用した場合に発生します（表1）。

表1.スプレッドを最小化するためのアプローチ。

スプレッドの原因		スプレッドの最小化
非常に明るい蛍光色素		蛍光強度および抗原密度に関する情報を利用します
非常に類似した蛍光色素		固有のスペクトル特性を持つ蛍光色素を選択してください
マルチレーザー励起の蛍光色素		励起の狭い蛍光色素を選択してください
蛍光スペクトルの広い蛍光色素		蛍光スペクトルの狭い蛍光色素を選択してください

スプレッドは相加的であり、発光は同じ波長で発光する実験におけるすべての蛍光色素からの影響により変化します。スプレッドを除去する方法はありませんが、推奨されるアプローチは、スプレッドの影響を最小限に抑えるパネルを設計するために、機器および蛍光色素の特性評価中にスプレッドを評価することです。単一染色サンプルを使用して、スプレッドマトリックスを生成できます[7]。これにより、特定の装置を用いて測定した蛍光色素の各ペアのシグナルの拡散量を定量します。スプレッドマトリックスの情報は、シグナルの拡散を送受信する蛍光色素の同定に役立ちます。図9はスプレッドマトリックスの例を示しています。詳細情報およびインタラクティブツールは、スペクトルフローサイトメトリーアッセイおよび試薬をご覧ください。

Graph showing spread matrix of 20 fluorophores

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図9.スプレッドマトリックス。スペクトルフローサイトメトリーの慎重なパネルデザインを行うには、サイトメーターの特性と蛍光色素分子の特性を理解する必要があります。この20の蛍光色素のスプレッドマトリックスは、3レーザー搭載のCytek Auroraスペクトルサイトメーターで収集した蛍光色素のスプレッドレベルを示しています。各行の蛍光色素は、各列の蛍光色素のスプレッドに影響します。マトリックス中のすべての蛍光色素は一緒に使用できますが、濃い赤色のシェードは、ある蛍光色素が他の蛍光色素へのスプレッドを増大させている箇所を示し、蛍光色素とターゲットを一致させる際に細心の注意が必要です。

ユニークなスペクトル特性、狭い励起、狭い発光特性を持つ蛍光色素の選択は、スプレッドを最小限に抑えるのに役立ちます。非常に類似した蛍光色素のペアは、相互に排他的な集団にのみ推奨されます。高いスプレッドを引き起こす蛍光色素は、低発現マーカーと組み合わせたり、スペクトルの異なる蛍光色素と組み合わせることにより、分解能を向上させることができます（図10）。特定のパネルを設計した後は、その特定のパネルのゲーティングストラテジーの中で、蛍光色素のスプレッドマトリックスを評価することをお勧めします。

Human lymphocytes labeled with CD56-APC to demonstrate spread and resolution

図10.スプレッドと解像度。ヒトリンパ球をCD56-APCおよびCD3で2つの異なる蛍光色素で標識し、スプレッドと分離を示しました。（A）APC-eFluor780で標識されたCD3は、CD56-APCに有意に拡散し、ダブルポジティブのCD3+CD56+細胞の分離を困難にします。（B）eFluor 450で標識されたCD3に変更すると、CD56-APCへの拡散が最小限に抑えられ、ダブルポジティブのCD3+CD56+細胞の分離が可能になります。

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