蛍光観察クイズ 答え合わせ

アクチンは、細胞骨格構造の維持、細胞運動性、細胞の連結、筋肉収縮および細胞シグナリングにおいて様々な役割を果たしており、細胞内で最も存在量の多いタンパク質の一つです。ファロイジンは、Fアクチンマイクロフィラメントに非常に強固かつ特異的に結合し、アクチンに対する他の多くの一次抗体とは異なり、マイクロフィラメント以外の形状のアクチンには結合しません。ファロイジンに蛍光色素をコンジュゲートさせることにより、細胞研究に蛍光顕微鏡を使用する細胞学者にとって非常に有用なツールとなります。

肉眼で見える光は通常400～700 nmの範囲にあり、虹の全色を含み、400 nm付近の青色に始まり、700 nm付近の赤色で終わります。一般的な蛍光顕微鏡において、発光された光を収集するCCDカメラは、人間の目よりも検出レンジが広いため、可視外の光を使用しても問題にはなりません。

パラホルムアルデヒドは タンパク質、ペプチド、酵素のアミノ基と反応し隣接する分子同士を架橋させる働きがあり、最もよく使われている固定剤です。ターゲットによっては、グルタルアルデヒドや冷アルコール固定が行われることもありますが、まずはパラホフムアルデヒドを使用することが多いです。

SYTOX 染色剤、ヨウ化プロピジウム、7-AAD は死細胞を検出するときに使用する核染色試薬です。C) Hoechst 染色剤、特に、Hoechst 33342が細胞透過性があり、生細胞の核を染色する際に利用されます。

RAW264.7 や MMM細胞 (marginal metallophilic macrophage) のような、核と細胞膜 の間の空間が非常に狭い細胞では 細胞骨格などの観察は難しいです。上皮系の細胞は、細胞体が大きく平らな形状のため、比較的細胞構造の観察が容易です。なお、HEK293細胞はトランスフェクションには広く利用されていますが、培養表面への接着が強固でないため、上皮由来細胞と比べると観察が行いにくい場合があります。

「赤く染色されているもの」は F-アクチン（蛍光標識ファロイジン）です。紫色のようにも見えますが・・・。F-アクチンについての解説はQ1をご覧ください。

「緑色に染色されているもの」は、核（SYTOX Green） です。SYTOX Greenは、正常な細胞膜を透過せず、dsDNAに結合すると強い蛍光を放つ、鮮やかな固定細胞の核染色試薬です。

「緑色に染色されているもの」は、ミトコンドリアです。ミトコンドリアは真核細胞にあり、細胞容積の10％ほどを占めます。ミトコンドリアを調べることで、ミトコンドリアの機能や細胞の代謝および健康状態に対するその影響を調べることができます。

図を見ていただいた方が分かりやすいので、蛍光と波長の原理をご参照ください。親指シフトをご存知のあなたは、バブル世代 or パソコンフリーク？

それぞれ、主に以下のレポータータンパク質の由来生物となります。

1. Renilla reniformis : Luciferase
2. Aequorea victoria : GFP
3. Entacmaea quadricolor: TurboRFP などのRFP

例えば、Renilla reniformis 由来の緑色蛍光タンパク質も存在するようですが、設問にある発見という意味では Aequorea victoria が正解となります。

テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）は、ミトコンドリアの膜電位に応じて蛍光強度が変化します。 アポトーシスを起こすと ミトコンドリアの膜電位が消失していき、それに伴って TMRMの蛍光シグナルも低下することから、アポトーシスマーカーの一つとして利用されることがあります。CellTracker CMFDA, Calcein AM, NBD C6-Ceramide には このような特性はありません。